细菌相关研究文献分享轻松读完一篇文献(一)

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鸡蛋是自然界中最有营养和最经济的食物之一。然而,食用生蛋或未煮熟的蛋或处理不当的蛋或蛋制品与食源性疾病的爆发密切相关。美国食品和药物管理局(FDA)估计,每年有79000例食源性疾病和30例死亡是由食用被沙门氏菌污染的鸡蛋引起的。仅在美国,每年生产的大约320万只鸡蛋受到肠炎沙门氏菌的污染,造成巨大的经济损失。这主要是由于鸡蛋在生产、运输、储存和销售过程中极易受到细菌污染。到目前为止,鸡蛋相关的疫情大多是由致病性沙门氏菌引起的,特别是鼠伤寒沙门氏菌(S. Typhimurium)和肠炎沙门氏菌。另一方面,虽然被非致病菌污染的鸡蛋一般不会直接导致人类疾病,但鸡蛋的营养价值和保质期会降低,从而造成巨大的经济损失。因此,为保证鸡蛋微生物的安全性和质量,鸡蛋中特定致病菌株和总细菌同时定量是非常重要的。

传统的培养依赖平板计数法是食品工业细菌负荷定量的标准方法,但该方法劳动强度大,耗时长,且难以检测活的但不可培养的(VBNC)细菌。另外,在食品样本中培养特定的致病菌株需要选择性电镀、预富集、选择性富集和鉴定,通常需要数天的时间才能得到结果。快速检测食品中的细菌病原体对于减轻食源性疾病的暴发至关重要,因为可以快速识别被污染的食品,防止疾病的进一步传播。为此,一些不需要培养的核酸方法,如聚合酶链反应(PCR)已被用于检测病原体。然而,食品样品成分对PCR的抑制会降低扩增效率。此外,扩增时间仍较长,需注意避免污染。虽然不经过培养的快速细菌定量对鸡蛋的要求很高,有两个主要障碍需要克服。首先,蛋黄的微、纳米结构成分,如含有低密度脂蛋白(LDL, 17-60 nm)的颗粒(非可溶性蛋白聚集物,0.3-2 μm)和血浆,以及所有蛋黄成分形成的油滴,可以粘附细菌或结合染色分子,从而影响定量的准确性。其次,鸡蛋中的细菌数量较少。因此,样品前处理的效率和检测技术的灵敏度是鸡蛋细菌污染检测的关键。为了避免卵基质成分的干扰,避开耗时的培养过程,Vinayaka等采用免疫磁珠捕获细菌,再结合PCR检测无培养富集的鼠伤寒沙门氏菌。Zeinhom等人开发了一种基于免疫磁珠和荧光标记抗体的三明治免疫传感器,然后结合便携式智能手机设备检测大肠杆菌O157:H7。然而,目前尚缺乏特异性病原菌和总细菌同时定量的方法。

流式细胞术(FCM)已被证明能有效定量特异性病原菌和总细菌。特别是流式细胞术通过提供单细胞的高通量、定量和多参数分析,在微生物学研究和诊断中越来越受欢迎。例如,Mcclelland等人使用牛奶澄清溶液分散鸡蛋中的油滴,然后使用溴化乙锭核酸染色结合荧光标记抗体,通过实验室构建的流式细胞仪检测鸡蛋中的鼠伤寒杆菌。然而,他们的流式细胞仪很难从背景信号中区分细菌细胞,而且已经证明使用清乳液很难彻底去除鸡蛋中的蛋白质和脂肪聚集体。

利用实验室建造的纳米流式细胞仪(nFCM),其灵敏度是传统流式细胞仪的数百倍,在这里,我们报道了一种快速和灵敏的方法,用于不需要培养的鸡蛋中致病性鼠伤寒杆菌和总细菌的定量。以添加鼠伤寒沙门氏菌和无害大肠杆菌K12 (E. coli K12)的鸡蛋为模型,对样品预处理方案进行优化。采用实验室构建的nFCM对单个细菌发出的同时侧散射、绿色荧光和红色荧光信号进行分析,SYTO 62核酸染色和免疫荧光标记Alexa Fluor 488 (AF488)偶联的抗鼠伤寒杆菌单克隆抗体(mAb)。对该方法的细菌回收率、检出限和特异性进行了研究。

鼠伤寒杆菌和大肠杆菌K12在LB肉汤中培养过夜,在600nm下,光密度为1.0 (OD600,由可见分光光度计检测)。5000g离心5min, PBS洗涤3次。除非另有说明,将洗过的细菌细胞重悬在PBS中,并调整到OD600为0.1(约1 ×10^8 cfu/ml)。收获的鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌K12细胞保存在4℃,用于后续实验。所有致病菌实验均按照致病菌实验室通用生物安全标准(WS 233-2017)进行。

从当地超市购买的新鲜带壳鸡蛋,用无菌水清洗,并用75%乙醇擦洗,去除蛋壳上的细菌。在无菌条件下打破鸡蛋,将蛋液收集到一个无菌折边摇瓶中。将收集到的蛋液放在轨道摇床培养箱上,在4℃下以250 rpm的速度摇10分钟。然后取100 μL液体移入1.5 mL eppendorf管中,加入630 μL PBS、200 μL Triton X-100(10%)和70 μL蛋白酶K (20 mg/mL)。将试管旋转搅拌均匀,然后在37℃下孵育20分钟,消化蛋白质和溶解脂肪。通过PP膜(5 μm孔径)过滤消化后的蛋液,去除未完全消化/溶解的残留颗粒。过滤后的蛋液5000 g离心5 min。小心取出900ul上清,加入900 μL PBS混匀。再次以5000 g离心5 min,小心取出900 μL上清,用100 μL的残留上清重悬颗粒。

取1ml收获的鼠伤寒杆菌、大肠杆菌K12或不同比例的鼠伤寒杆菌和大肠杆菌K12细胞的混合物,在5000 g下离心5分钟,然后在1ml蛋液中重悬。然后将100 μL加菌蛋液移入1.5 mL eppendorf管中。当样品量增加到1.0 mL时,取1.0 mL加入细菌的蛋液加入15ml的eppendorf管中,加入6.3 mL PBS, 2ml Triton X-100(10%)和700 μl蛋白酶K (20 mg/mL)。将试管旋转搅拌均匀,然后在37℃下孵育20分钟,以消化蛋白质和溶解脂肪。通过PP膜(5μm孔径)过滤消化后的蛋液,去除未完全消化/溶解的残留颗粒。将过滤后的液蛋在5000 g下离心5 min,小心取出9ml上清液,将残留的1ml溶液移至1.5 mL eppendorf管中。5000 g离心洗涤2次,5 min,小心取出900 μL上清,用100 μL的残留上清重悬颗粒。

将1 μL SYTO 62 (500 μM)加入50 μL鸡蛋液中,混合均匀,对鸡蛋样品中的细菌进行核酸染色。染色样品在nFCM分析前在室温黑暗中保存10分钟。对细菌进行双荧光染色,将1 μL AF488偶联的抗鼠伤寒杆菌单抗(500 μg/mL)加入50 μL制备的液蛋中,37°C避光孵育30 min。注意免疫荧光染色时未进行洗涤。然后,加入1 μL SYTO 62 (500 μM),室温孵育10 min后,用nFCM进行分析。每次实验都以未添加细菌的鸡蛋样本作为阴性对照。

100ul添加了大肠杆菌k12的鸡蛋样品的十倍稀释液直接铺在LB琼脂上,重复3次。培养皿在37°C下孵育24小时。

nFCM配备了三个光电倍增管(PMTs),用于同时检测侧散射(SS)和两个荧光(FL)通道(图S1a)。用200mw 488 nm连续波激光器(Sapphire 488 LP, Coherent, USA)衰减到20mw作为激光源。用显微镜物镜(CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 40XC,尼康,日本)垂直于激光束和样品流收集单个细菌发出的光。然后用两个二色分光器(FF500-Di01和FF605-Di02, Semrock)将光定向到3个光路,用于同时检测SS、绿色FL (FF01−520/35,LP01-488RU, Semrock)和红色FL (FB70040, Thorlabs)。每个通道使用一个光电倍增管(PMT, R928,滨松,日本)。除非另有说明,每个样本都进行了60秒的数据采集。采用直径为200±9 nm的荧光球(Invitrogen, CA, USA)来校准细菌计数的样品流速。AF488和SYTO 62的吸收光谱和荧光发射光谱以及两个带通滤波器的透射范围如图S1b所示。在nFCM装置中,使用10 mm焦距的消色差双透镜将0.7 mm直径的激光输出光束聚焦到~9 μm直径的光斑(1/e2)上,聚焦到~4 μm的样品流上。因此,样品流在聚焦激光束中心被完全照亮,检测效率接近100%。通过样品流和激光束的重叠,检测体积为~0.11 pL。根据泊松分布,对于浓度为10^8个细胞/mL的细菌样本,计算出两种细菌同时驻留在检测体积中的概率小于0.006%。

图5. 采用双荧光染色法对新鲜鸡蛋加入不同比例的鼠伤寒杆菌和大肠杆菌K12细胞混合菌进行nFCM分析

图6. nFCM检测超市新鲜鸡蛋和不适当储存变质鸡蛋中的致病性鼠伤寒杆菌和总细菌。预处理前,每个鸡蛋样品浓度从1ml浓缩至100 μL

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