武夷山地衣表生和内生芽孢杆菌种群的多样性

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资助课题: 科技部973前期项目(2011CB111607);国家自然科学基金项目(31370059);公益性行业(农业)科研专项(201303094);科技部国际合作项目(2012DFA31120): 【目的】 分析武夷山地衣表生和内生芽孢杆菌种群的多样性。【方法】 从武夷山自然保护区采集扁枝衣属()等分属于7科9属的地衣样品9份,分离地衣表面附生(表生)和内生芽孢杆菌,并根据16S rRNA基因序列同源性对分离得到的芽孢杆菌进行种的鉴定。【结果】 未从扁枝衣属、树花属()的3个样品中分离出表生或内生芽孢杆菌,从另外6个样品中分离出芽孢杆菌34株,分别鉴定为芽孢杆菌属()的24个种。类芽孢杆菌属、芽孢杆菌属是这些地衣表生、内生芽孢杆菌的优势种群,分别占分离得到菌株的41.2%(14株)和35.3%(12株);短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属和绿芽孢杆菌属为首次报道从地衣中分离获得。从不同的地衣样品分离的表生和内生芽孢杆菌的种类、数量存在差异。蜈蚣衣属(cfu/g,而珊瑚枝属表面附生和内生芽孢杆菌的种类最多、共有12个种。分离到的芽孢杆菌大部分来自单独的一种地衣;台中类芽孢杆菌()分布最广,在蜈蚣衣属、珊瑚枝属等4种地衣中都有存在。【结论】 武夷山地衣表生和内生芽孢杆菌存在种类和数量的多样性。species inhabiting on the surface and endophyte of lichens collected from Wuyi Mountain1. Institute of Agrobiological Resources, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, Fujian Province, China;

地衣是由真菌与藻类或蓝细菌经过漫长的生物演化形成的一类具有高度遗传稳定性的共生联合复合有机体[1];但在本质上,地衣是一大类专化型真菌有控制地寄生于光合微生物——藻类或蓝细菌,因此地衣亦称为地衣型线]。地衣在自然界广泛分布,目前,全世界已描述的地衣有500余属、26000余种,中国有232属1766种[3]。地衣由于其共生的特殊性,能产生多种初生代谢产物(多糖类)和次生代谢产物(酚酸类),构成了天然有机化合物的独特类群宝库[4]。地衣还可以作为草药[5]、食品[6]和饲料[7]等直接利用;地衣能够促使岩石分化和土壤形成,为其他植物开辟了生长的土地,故也称作是自然界的先锋植物[8];地衣对环境质量尤其空气质量要求较高、对大气污染物敏感,可利用其作为指示生物监测、评定大气质量[9]。正是由于地衣存在诸多特殊性,因此对地衣的形态学、生理学、生态学、系统分类学等方面的研究已经、并将持续引起各国学者的重视。关于地衣表生和内生细菌的研究,有过许多的报道。Selbmann等

10]分析了采自南极洲的16份地衣样品中可培养细菌的群落状况,结果从5份样品的表面和内部分别分离出20、10个菌株,其中大部分属于放线菌纲,少部分菌株分别属于类芽孢杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属和奇异球菌属。Massimiliano等[11]从奥地利、法国的Cladonia、Hypogymnia、Pseudevernia和Roccella属11种地衣中分离出34株细菌,其中类芽孢杆菌属和芽孢杆菌属的菌株分别有9株、4株,其余的菌株分别归于8个属。Grube等[12]采用荧光原位杂交、共聚焦激光显微扫描等方法分析了Cladonia arbuscula、Lecanora polytropa、Umbilicaria cylindrica中细菌群落的多样性,结果表明可培养细菌主要是不动杆菌属(Acinetobacter)、伯克氏菌属、甲基杆菌属(Methylobacterium)、芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属等,优势菌群为α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)。Grube等[13]和Aschenbrenner等[14]分析了不同肺衣伴生细菌(associated bacteria)群落的状况,结果表明这些细菌的大部分属于变形杆菌门,同时还有鞘脂杆菌门(Sphingobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)等。Lee等[15]从采自南极、北极的地衣中分离出68个菌株,经16S rRNA序列鉴定为26个种,其中变形杆菌门有44株,放线个地衣样品中分离出能固氮的菌株16株,经16S rRNA序列鉴定,均属于变形杆菌门。张群林等[17]也从地衣分离到6个苏云金芽孢杆菌菌株。而关于地衣中细菌对地衣生长的作用,也主要认为是固氮、解磷、分泌生长激素、产生抗菌物质等[10,11,12,13,14,16]。这表明,截至目前,对地衣中芽孢杆菌研究的较少,其种类分布、种群结构、生理功能、与地衣的相互作用等有待于更多的研究,对地衣表生及内生芽胞杆菌种类的调查是研究地衣与芽孢杆菌相互作用的基础。武夷山自然保护区是世界上同纬度带现存面积最大、保存最完整的中带森林生态系统,以“生物模式标本”名扬海内外。武夷山自然保护区的地衣资源丰富,分布着多种稀有的地衣类群[18]。本研究对采自武夷山自然保护区的地衣进行表面附生和内生芽孢杆菌的分离,以期了解该保护区地衣表面附生和内生芽孢杆菌的分布状况,丰富芽孢杆菌的菌株资源,并为研究地衣与芽孢杆菌间的相互关系提供基础。

1 材料和方法1.1 地衣的采集地衣样品采自武夷山自然保护区内的黄岗山、桐木关、大竹岚等地;采集时,用采集刀小心地将地衣从其附着的岩石、土壤或基质表面剥离,放入无菌袋内,带回实验室进行芽孢杆菌的分离。采集的地衣的相关信息见

将采集的地衣放置在干净的培养皿上,小心地用手术刀切下地衣的叶状体(或子实体),称重,然后将叶状体用20 mL的无菌水浸泡、振荡30 min;取少量浸泡地衣后的无菌水、80℃水浴10 min后涂LB培养基平板,30℃培养箱内培养,分离地衣表面附生(简称表生)的芽孢杆菌。将浸泡后的叶状体用75%酒精浸泡处理30 s,用10%次氯酸钠溶液浸泡消毒5 min,再用无菌水漂洗3遍(取少量最后一遍的无菌水漂洗液涂LB培养基平板,以检查地衣表面是否消毒干净),放置于无菌研钵中,加入2 mL无菌水,充分研磨至匀浆状,转移入无菌试管,80℃水浴10 min后进行10倍系列稀释至10

和10-3稀释液各0.2 mL涂LB培养基平板(每个浓度重复3次),放置在30℃培养箱内培养。培养3 d后,观察各平板上的菌落生长状况,描述不同菌落的形态、颜色、大小等特征,并进行编号、计数,计算各地衣样品同类菌落的数量及芽孢杆菌总含量。挑取形态不同的单菌落进行划线培养,直至获得纯培养,并用-80℃冷冻法保藏。1.4 芽孢杆菌DNA的提取和16S rRNA基因序列的扩增与测定采用苯酚-氯仿法提取DNA;采用细菌16S rRNA基因序列的通用引物

酶和1 μL DNA模板。PCR反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,55℃退火45 s,72℃延伸1 min 30 s,35个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物的检测:取2 μL PCR产物,点样于1.5%的琼脂糖凝胶中,电压100 V电泳40 min,EB染色,用凝胶成像系统观察结果。PCR产物由上海博尚生物技术有限公司进行测序,并将测得的序列在网站EzTaxon[20](进行比对。1.5 芽孢杆菌的系统发育分析根据对分离得到的芽孢杆菌16S rRNA基因序列鉴定的结果,分析、统计各个地衣分离出的芽孢杆菌的种类和数量状况;选择相关参考菌株的16S rRNA基因序列,再经ClustalX[21

-23]对芽孢杆菌的16S rRNA基因序列进行聚类分析(方法为Neighbour-Joining),构建聚类树。1.6 地衣表生、内生芽孢杆菌种群多样性分析引入群落生态学多样性指数香农-威纳(Shannon-Wiener)指数(H),对不同属地衣表生、内生芽孢杆菌的种类和数量的多样性指数进行分析;Shannon-Wiener多样性指数(

i为i种芽孢杆菌的数量,N为某个属的表生(或内生)芽孢杆菌的总量。为区分不同地衣属芽孢杆菌的种群数量,以芽孢杆菌的数量为指标、以芽孢杆菌种类为样本,用欧氏距离法对芽孢杆菌的种群数量进行系统聚类,分析各类群的特点。2 结果和分析2.1 地衣表生与内生芽孢杆菌的分离与鉴定

)等3个样品中分离出表生或内生芽孢杆菌,从袋衣属(Hypogymnia)、脐衣属(Umbilicaria)和蜈蚣衣属(Physcia)3个样品中只分离出表生菌,从珊瑚枝属(Stereocaulon)、孔叶衣属(Menegazzia)和石蕊属(Cladonia)的3个样品中分离得到表生和内生芽孢杆菌;分离出的表生及内生芽孢杆菌共34株(表2)。经16S rRNA基因序列测定、比对,可初步将这34株芽孢杆菌鉴定为24个种。表 2.

含量比表生的大。在只分离出表生芽孢杆菌的3个地衣属样品中,从蜈蚣衣属中分离出芽孢杆菌种类最多、有4种,分别为菌株FJAT-17096、FJAT-17100、FJAT-17102和FJAT-17106;蜈蚣衣属表生芽孢杆菌的数量也最大,特别是FJAT-17102,含量达2.68×106cfu/g。从袋衣属地衣中分离出2种表生芽孢杆菌,即菌株FJAT-17080和FJAT-17082;从脐衣属地衣中只分离出1种表生芽孢杆菌,即菌株FJAT-17102。利用Clustal X软件,将从各地衣样品中分离出的34株芽孢杆菌及其对应参考菌株的16S rRNA基因序列进行比对,再用MEGA 4软件构建的系统进化树如

所示。从图中可以看出,这34株芽孢杆菌主要聚为3大类:第一类包括Bacillus属的8个种、

,孔叶衣属、蜈蚣衣属、珊瑚枝属中都有Bacillus mycoides;上述种类之外的芽孢杆菌,则为各地衣属特有的种类,如石蕊属的Bacillus aerophilus,袋衣属的Bacillus nealsonii等。不同属的地衣,分离出表生芽孢杆菌种类数不同,珊瑚枝属的最多、有8种,孔叶衣属和蜈蚣衣属分别有6、4种;石蕊属和袋衣属都是2种;在表生芽孢杆菌中,不同芽孢杆菌属的比例也不同,石蕊属、袋衣属、珊瑚枝属和孔叶衣属地衣分离出的表生芽孢杆菌,Bacillus属的种类均占50%;蜈蚣衣属的表生芽孢杆菌中,Paenibacillus属的占75%。总的来看,表生芽孢杆菌中,Bacillus属、Paenibacillus属的种类各有8个,Lysinibacillus属的2个,Brevibacillus属的种类1个。表 3.

、Umbilicaria和Stereocaulon4个属的地衣,其特征是表生芽孢杆菌种群数量较少;第二类是Menegazzia,其特征是表生芽孢杆菌种群数量较大;第三类是Physcia,其特征是表生芽孢杆菌种群数量大,达3.85×106cfu/g。

cfu/g。为区分不同内生芽孢杆菌的种群数量,以芽孢杆菌的数量为指标、以芽孢杆菌种类为样本,用欧氏距离法对地衣内生芽孢杆菌的种群数量进行系统聚类,结果见图4。当λ=17.9时,可将这些内生芽孢杆菌种群分为3类:第一类有P. uliginis、

、P. amylolyticus等7种芽孢杆菌,其特征是种群数量较少;第二类有P. odorifer一种芽孢杆菌,种群数量较多;第三类也只有P. taichungensis一种,其特征是种群数量大。

在石蕊属表面以及孔叶衣属的内部、表面都有分布,且多样性指数最大;P. taichungensis也是有3种存在状态,且种群数量最大,但多样性指数却较低;B. agri和P. odorifer,都存在于2种地衣中,分别为袋衣属、珊瑚枝属和珊瑚枝属、孔叶衣属,但B. agri的多样性指数更大;B. acidiceler、P. panacisoli和V. arenosi等其他19种芽孢杆菌,都只存在于一种地衣,多样性指数为0。表 5.

)等[11];近年来,随着分子生物学和显微技术的发展,酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)等的多个属[10,11,12,13,14,15,16]细菌被确认存在于地衣中,其中变形菌纲是主要的类群。本研究从石蕊属、袋衣属、孔叶衣属等6个不同的地衣样品中分离到表生及内生芽孢杆菌34株,分别属于5个属、24个种(有1个种为疑似新种),其中类芽孢杆菌属和芽孢杆菌属菌株分别有14、12株,为优势菌株,短芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属和绿芽孢杆菌属为首次报道从地衣中分离出来;有些种类的芽孢杆菌,如蕈状芽孢杆菌、台中类芽孢杆菌,能从不同的地衣中分离得到;还有些芽孢杆菌,如解木糖赖氨酸芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌,能存在于同一种地衣的表面和内部。早期从地衣中分离出的细菌,大部分都具有固氮作用,而且类芽孢杆菌属的相当一部分菌株,也具有较强的固氮能力[24];至于本研究分离出的芽孢杆菌、尤其是占优势地位的类芽孢杆菌属菌株是否具有固氮作用,有待于进一步研究。本研究用于分离芽孢杆菌的9个地衣样品,归于不同的属,且生长基物、生长型存在差异。不同的地衣,分离出的表生芽孢杆菌和内生芽孢杆菌的种类和数量存在差别,扁枝衣属、树花属和茶渍属等3个样品中没有分离出芽孢杆菌;珊瑚枝属表生和内生芽孢杆菌的种类最多,而蜈蚣衣属表生的芽孢杆菌数量最多;不同的地衣,也可以分离出相同种类的表生或内生芽孢杆菌,即地衣表生或内生芽孢杆菌存在种类、数量的多样性,这可能是因为地衣表面及内部细菌群落的组成与结构,主要受地衣种类、地理位置、地衣生长的基物和生境等因素的影响[25-26]。本研究从蜈蚣衣属分离出的芽孢杆菌数量达3.85×10

cfu/g以上,这验证了Lenova和Blum[27]的说法,即某些地衣的每克叶状体存在的细菌数量可达百万个以上;Grube等[12]、Cardinale等[28]、Bjelland等[29]的研究结果也表明了部分地衣中存在着数量巨大(107-108,甚至达1011)非蓝藻类细菌。植物内生菌(Plant Endophyte)是指其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的一类微生物,包括真菌、细菌和放线菌。内生菌广泛存在于藻类、苔藓、蕨类、裸子和被子植物的根、茎、叶、花、果实和种子等组织的细胞或细胞间隙中,与宿主植物间形成了协同进化和互惠共生的关系。迄今为止,人们已经先后从玉米、马铃薯、红树、大蒜、水稻和烟草等许多植物中分离得到多种内生细菌[30-35],其中以假单胞菌、芽孢杆菌、肠杆菌以及土壤杆菌为最常见的优势种群。地衣也可以被认为是由低等植物中的藻类与菌类中的真菌共生而成的一群特殊的植物,本研究从3个属的地衣样品中分离出内生芽孢杆菌10株、分属于5个属,其中以类芽孢杆菌属的菌株为最多。这表明,一些种类的地衣也存在着种类、数量不一的内生芽孢杆菌。至于地衣与其表生、内生芽孢杆菌之间的相互关系,也有待于进一步的研究。

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