免疫文献速递肠道菌群再次扩张 可通过 cGAS-STING 获取

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先天免疫是机体抵御病毒入侵的第一道防线,而I型干扰素(IFN-I)介导的抗病毒反应是先天免疫的重要组成部分。 在过去几十年的研究中,已有大量文献表明微生物菌群在调节IFN-I方面发挥着重要作用。 早期的研究主要集中在TLR信号通路上(与早期认为肠道微生物主要是细菌有关)。 )[1]。 然而,关于TLR信号通路的具体机制仍存在许多争议和未知[2]。 微生物群是否仅通过这种机制促进 IFN-I 启动的先天免疫仍不清楚。 此外,肠道细菌如何与远端调节免疫细胞通讯以及介导全身免疫调节的机制也不清楚。

基于此,本文作者Saskia F. Erttmann(第一作者)和Gekara Nelson O(通讯作者)利用一系列基因敲除小鼠模型对IFN-I涉及的自然免疫通路进行了全面分析并发现肠道细菌群通过膜囊泡(MV)介导将细菌DNA递送至远程宿主细胞,激活cGAS-STING-IFN-I信号通路并启动人体针对病毒的先天免疫。 该研究于2022年5月10日发表在《免疫》杂志上,标题为“肠道微生物群通过cGAS-STING-IFN-I轴启动系统性抗病毒免疫”。

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研究成果

1. 肠道菌群是病毒感染先天免疫的关键

患者通常自行使用抗生素来“治疗”未确诊的疾病,有时也将抗生素给予病毒感染患者,作为针对病毒感染后经常发生的细菌感染的预防措施。 同时,抗生素也会影响肠道微生物群。 抗生素治疗后微生物的变化是否也会影响病毒感染的解决仍然是病毒感染管理中的一个突出问题。

为了研究抗生素抑制微生物群对病毒感染结果的影响,作者给小鼠口服氨苄西林、新霉素和万古霉素的抗生素混合物(图 1A)。 收集小鼠粪便颗粒进行 16S rDNA 测序和 PCR 定量分析。 结果显示,接受抗生素治疗的小鼠肠道细菌群落显着减少(图1B、图1C)。

当用1型单纯疱疹病毒(HSV-1)进行鼻内或鼻内攻击以诱导局部肺部或全身感染时,他们发现接受抗生素治疗的小鼠中HSV-1复制率更高,并且这些小鼠的临床症状更严重(图1)。 .1D-图1G)。 这意味着共生肠道细菌有助于病毒感染后的系统先天免疫,并可以保护远端器官。

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图 1. 肠道微生物群对于抗病毒先天免疫至关重要。

背景 小鼠体内的 IFN-Is 对于病毒感染的先天免疫至关重要。 为了评估抗生素治疗后病毒复制的增强是否可能对肠道共生细菌引发的 IFN-I 产生影响,我们测量了 Ifnb1 荧光素酶报告小鼠的基础 IFN-I 水平(图 2A)。 口服抗生素导致全身基础Ifnb1水平降低(图2A)。 此外,小鼠结肠组织的RNA-Seq测序数据显示,在口服抗生素治疗的小鼠中,干扰素刺激基因ISG和促炎细胞因子的表达降低(图2B)。 这些数据表明,抗生素治疗组的小鼠在病毒感染后遭受了更严重的损害,并且病毒在体内复制的速度更高。 肠道菌群对于先天免疫至关重要。 抗生素治疗后,肠道细菌的减少导致 Ifnb1 水平降低,小鼠先天免疫力减弱。 因此,肠道细菌在感染病毒后通过IFN-1产生先天免疫。

2.肠道菌群通过STING驱动全身IFN-I启动

那么,肠道细菌如何通过IFN-1激活先天免疫呢?

为了剖析哪些先天免疫途径有助于微生物群驱动的 IFN-I 启动,作者进一步开发了缺乏不同先天免疫途径受体的 Ifnb1 荧光素酶报告小鼠(图 2C、图 2D)。 结果显示,敲除TLR通路的小鼠的基础IFN-I反应没有显着变化(图2E、图2F),这意味着全身性IFN-I启动在很大程度上独立于TLR。 TIS联合敲除小鼠和IS敲除小鼠的IFN-1水平显着降低,而STING通路敲除小鼠的基础Ifnb1水平显着降低(图2G-2I)。 研究发现Sting信号通路是体内激活IFN-1信号传导的关键。

为了验证肠道细菌是否通过Sting途径触发IFN-1产生先天免疫。 如图2B所示,与Sting敲除小鼠结肠的RNA-seq测序结果相比,发现口服抗生素后增加的ISG基因在Sting敲除后也增加了。 也就是说,口服抗生素消除了WT和Sing敲除小鼠之间ISG相关基因的差异和IFN-1的减少(图2J,图2K)。 粪便细菌移植恢复了 WT 小鼠的 Ifnb1 反应,但没有恢复 Sting 敲除小鼠的反应(图 2J、图 2K)。 因此,作者认为肠道细菌通过STING途径触发IFN-1产生先天免疫。

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图 2. 肠道微生物群引发的 IFN-I 涉及胞质 STING 途径。

3.细菌MV激活STING-IFN-I轴促进抗病毒先天免疫

随后,之前的一项研究发现了一种缺乏 ΔlpxM 的大肠杆菌物种 [3]。 正常的大肠杆菌可以通过LPS的增加导致TLR4增加,导致身体产生败血症等症状。 与正常大肠杆菌相比,ΔlpxM突变型大肠杆菌没有上述临床症状,但可引起小鼠Sting-IFN-1水平升高。

当大肠杆菌和小鼠骨髓巨噬细胞 (BMDM) 直接接触培养时,以及当 ΔlpxM 突变体与 BMDM 在 Transwell 系统中共孵育时(以防止细菌和宿主细胞之间的直接相互作用),大肠杆菌 ΔlpxM可以同时诱导突变体,WT组和刺击敲除小鼠中WT IFN-1增加,但增加在WT组更显着,表明大肠杆菌及其突变体引起的IFN-1增加确实部分由 Sting-IFN-1 轴引起。 (图3A、图3B)。

然而,在细菌和宿主细胞之间没有直接接触的情况下,细胞外细菌如何触发 STING-IFN-I 轴呢? 先前的研究表明,细菌可以释放小的脂质双层囊泡:MVs,直径为20~250 nm(图3C)。 MV 可以携带含有细菌成分的有效负载,并且可以穿过肠道组织和细胞膜屏障。 在将细菌成分输送到其他细胞膜和组织中发挥作用,从而激活局部和远端 STING 通路。 为了验证这一假设,研究人员从大肠杆菌中纯化了 MV,并检查了它们在体内激活免疫反应的能力。 大肠杆菌及其突变体的 MV 在形态上相似,并且含有相当数量的 DNA(图 3C、图 3D)。 与直接注射活菌类似,从两种细菌中提取的MV接种到腹腔后,来自WT大肠杆菌的MV在小鼠中诱导了严重的败血症症状,例如(临床评分增加、体温下降、体重下降)。 。 同样一致的是,ΔlpxM突变体的MV不会引起上述症状(图3E-3G)。 体内成像结果表明,两种大肠杆菌MV均可引起小鼠体内IIFN-1的增加(图3H)。 因此,就像活细菌一样,从细菌中纯化的 MV 会激活 IFN-I 升高,并且这种反应与 LPS-TLR 信号传导和相关的免疫病理学无关。 接下来,我们进一步验证了MV介导的STING-IFN-I轴是否会启动抗病毒先天免疫。 因此,在用两种毒株的MV预处理后,来自WT、TLR途径缺陷型以及TLR和RLR途径缺陷型小鼠的BMDM对HSV-1具有高度抵抗性。 从细菌中纯化的 MV 可激活 IFN-I,从而增强和促进抗病毒先天免疫。

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图 3. 专性细胞外细菌 MV 启动 STING-IFN-I 轴以防止病毒感染。

为了评估 MV 介导的细菌 IFN-I 启动是否可以提供针对体内病毒感染的保护,我们给小鼠注射了 WT 和 ΔlpxM 大肠杆菌以及分离的 MV。 两周后,在诱导的 IFN-I 反应消退后,小鼠再次感染 HSV-1(图 4A)。 结果显示,活的大肠杆菌或其MV显着提高了两只小鼠对HSV-1的抵抗力(图4B-4D)。 这些数据表明,细胞外细菌通过 MV 启动 STING-IFN-I 系统,从而促进小鼠对 HSV-1 的先天免疫。

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图 4. 细菌 MV 启动 STING-IFN-I 轴以促进抗病毒免疫。

4. 细菌 MV 将 DNA 递送至宿主细胞中以启动 cGAS-STING-IFN-I 轴

这篇论文的作者选择了另一种胃肠道细菌——霍乱弧菌,它表达一种膜破坏性溶细胞素,这种素可能允许细菌成分进入细胞膜,从而产生先天免疫。 溶细胞素缺陷的Δvcc突变体用作ΔlpxM突变体大肠杆菌的平行对照。

为了探索 MV 介导的 STING-IFN-I 轴激活机制,作者首先观察 MV 是否含有 DNA。 琼脂糖凝胶分析显示MV中存在DNA(图5A、图5B)。 用苄基酶处理去除泡外DNA后,MV仍然能够在小鼠和BMDM中诱导Ifnb1的高表达(图5C,图5D)。 这些结果表明,MV 将 DNA 封装在其内部,以保护这些 DNA 免受细胞外核酸酶的影响,从而促进它们递送到宿主细胞中,进而导致 STING 激活。

除了 DNA 之外,细菌还可以产生环状二核苷酸 (CDN),它可以独立于 cGAS 直接激活 STING-IFN-I 轴。 为了探讨cGAS是否能够感知细菌MV中的DNA,从而介导STING-IFN-I的启动。 表达 STING 但不表达 cGAS 的 HEK293 细胞可用于评估 STING 是直接激活还是通过 cGAS 激活。 作者构建了含有 IFN-Mx2 荧光素酶报告基因的 293 稳定细胞系。 在用cGAS (pBabe-cGAS)或对照载体(pBabe-empty)转染的293细胞中,添加霍乱病毒Δvcc和大肠杆菌ΔlpxM突变体的MV。 结果发现,只有过表达cGAS的293细胞系才能激活IFN-1的表达。 这表明MVs介导的IFN-I启动需要cGAS感应细菌DNA的参与(图5E,图5F)。 这表明MVs介导的IFN-I启动需要cGAS的参与,cGAS可感知细菌DNA。 当缺乏cGAS或STING的BMDM与transwell系统中的细菌或MV一起孵育时,Ifnb1响应较低(图5G,图5H)。 上述结果表明,胞外细菌激活cGAS-STING途径,该途径依赖于MV介导的细菌DNA向宿主细胞的递送(图5I)。

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图 5. 细菌 MV 包裹 DNA 并将其递送到宿主细胞质中以激活 cGAS-STING-IFN-I 信号传导。

5. 含有 DNA 的肠道细菌衍生的 MV 进入血液循环并通过 cGAS 驱动全身 IFN-I 启动

接下来,作者想知道 MV 是否由共生肠道细菌产生并在体内发挥作用。 因此,从小鼠粪便和血液中分离出MV并进行16S rDNA测序。 结果显示,小鼠粪便和血液中均含有携带细菌DNA的MV。 它们的组成和丰度相似,主要来自厚壁菌门和假单胞菌门。 细菌、变形菌门和放线菌门(图6A、图6B)。 这些数据表明肠道细菌群落释放出含有 DNA 的 MV,这些 MV 不仅存在于肠道中,而且还存在于体循环中。 此外,他们发现MV携带的DNA受到核酸酶的保护,这一特征可能有助于将DNA传递到远处的宿主细胞。

为了评估肠道微生物群驱动的 IFN-I 启动是否涉及细菌 DNA 的 cGAS 传感,我们分析了缺乏 cGAS 敲除的小鼠的全身 IFN-I 水平。 与对照小鼠相比,cGAS 敲除小鼠的 IFN-I 反应降低。 抗生素治疗消除了这种差异。 肠道菌群自发地在同一个笼子里重新定殖了小鼠。 抗生素治疗后的对照小鼠基础IFN-I完全恢复,而cGAS敲除小鼠中IFN-I水平没有变化(图6C)。 证明 cGAS 对于肠道微生物群诱导的系统性 IFN-I 启动至关重要。 上述结果证明肠道菌群产生的含有DNA的MV可以进入血液循环,解释了菌群驱动下系统启动依赖于cGAS-STING的IFN-I来抵抗病毒感染。

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图 6. 肠道细菌将含有 DNA 的 MV 释放到血液中,并通过 cGAS 驱动全身 IFN-I 启动。

6. 通过 cGAS-STING 启动菌群驱动的 IFN-I 可以预防 RNA 病毒

作者进一步探讨了 cGAS-STING 诱导的菌群驱动的 IFN-I 是否也能提供针对 RNA 病毒的保护。 当感染RNA病毒水泡性口炎病毒(VSV)时,与WT小鼠相比,Sting基因敲除小鼠和cGAS基因敲除小鼠产生的IFN-I反应较弱,清除病毒的能力降低,而口服抗生素可以抵消这种反应。 观察到了这种差异(图7A-7G)。 这些结果表明,虽然 cGAS-STING 充当 DNA 传感器,但通过 STING 启动菌群驱动的 IFN-I 也赋予宿主对 RNA 病毒的先天抵抗力。

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图 7. 通过 cGAS-STING 启动微生物群驱动的 IFN-I,促进对 RNA 病毒 VSV 的抵抗。

概括

这项研究表明,细胞膜先天免疫 DNA 传感器 cGAS 对于感知肠道微生物群至关重要,这对于产生对病毒感染的先天抵抗力也很重要。 这种由微生物群驱动的抗病毒先天免疫不需要宿主和细菌之间的直接接触,而是依赖于MV介导的细菌DNA向远程宿主细胞的传递。

该研究还表明,“在病毒感染期间使用抗生素的风险被低估了。” 正如格卡拉指出的那样,“在当今全球病毒大流行的时代,一个相关且也许是及时的信息是,过度使用抗生素会加剧病毒感染。” 研究人员的研究结果强调了肠道微生物群在维持免疫系统针对病毒的持续准备状态方面的重要性,并强调了病毒感染期间不适当使用抗生素的风险被低估。

参考

[1] Stefan KL,Kim MV,Iwasaki A,等。 关键词: 共生微生物群, 调节病毒感染, 天然抵抗力细胞,2020,183(5):1312-1324.e10。

[2] Schaupp L、Muth S、Rogell L 等。 微生物群诱导的 I 型干扰素指示树突状细胞的平衡基础状态[J]。 细胞,2020,181(5)。

[3] Somerville J、Cassiano L、Bainbridge B 等人。 一种产生抗炎脂多糖的新型大肠杆菌脂质A突变体[J]. 临床研究杂志,1996,97(2):359-365。

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